技术干货 | 双特异性抗体下游纯化技术浅析（下）
2025/09/28
# 双抗简介 # 双特异性抗体（bispecific antibody, BsAb）是一类能够同时靶向两个不同抗原表位的治疗性抗体。相较于传统单抗，双抗在肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾病和感染性疾病中展现出更高的特异性和更低的副作用风险，目前全球已有超14款双抗药物获批上市。 ?不同结构双抗的分类与特点 双抗主要由基因重组技术进行生产，分子设计类型多样，满足双抗分子识别两种不同抗原的能力。根据是否含Fc片段可以将双抗分为lgG-like和Non lgG-like 两类。 ?IgG-like 双特异性抗体 该类抗体分子含有Fc区,因此保留了 ADCC 和 CDC 效应,可以增强肿瘤的杀伤效果，同时使双抗分子具有半衰期长，稳定性好的优势。 双抗表达时，若分子未特殊设计，理论上会有超过10 种的副产物，主要包括重链之间错配引起的同源抗体 (homodimer Fcspecies)，轻链与重链之间错配引起的异源抗体 (heterodimeric Fcspecies)，结构不完整的片段抗体，如半抗体 (half antibody) 或 3/4 抗体，以及轻链聚集体 (light chain dimer)，重链聚集体 (heavy chaindimer) 等。 图· 双抗重组表达过程中可能产生的副产物类型 ?Non lgG-like 双特异性抗体 还有一类双抗分子，即各种不含有Fc区的 Non lgG-like 的双特异性抗体。这些双抗分子结构各异，在临床应用上因为分子体积小，具有免疫原性低，组织穿透能力强的优势；在表达策略上，由于不需要复杂的翻译后修饰可以灵活选择大肠杆菌，酵母菌，CHO 细胞等多种表达体系。 由于其分子结构中不含有Fc 区域，在下游纯化工艺选择上，就不能利用成熟的蛋白A亲和层析方法。 ?双抗纯化挑战 所有分子设计策略都只能尽量降低某类副产物的产生，而不能完全消除全部的副产物。而且在双抗的重组表达过程，还不可避免的会产生不完整的片段抗体以及聚集体，都会给双抗分子的下游工艺开发提出了挑战。 错配问题：在细胞培养过程中，由于多种重链（HC）和轻链（LC）的共表达，双抗容易发生HC和LC的错配现象，导致大量具有相似大小和性质的非功能性或单特异性抗体的产生。若完全随机配对，错配产物的比例可能会超过90%。 片段缺失：缺失HC或LC的双抗片段是常见的副产物。 聚体形成：研究表明，基于片段的bsAb由于Fc区的缺失，比传统的IgG更容易形成聚体。对称型bsAb也被观察到具有较高的聚体倾向（聚体比例高达50%）。这种倾向可能部分是由于链长度和灵活性的增加，导致分子间结构域更容易发生交换。 副产物杂质类型 产品相关杂质：如同源二聚体、片段污染物、聚集体 工艺相关杂质：如宿主细胞蛋白、病毒、内毒素 ?Non IgG-like BsAb 的下游纯化策略 Non lgG-like BsAb，是相对较简单设计的分子，多个抗原结合单元(即抗体片段)结合在一个没有Fc区域的分子上，从而避免了链交联问题。结构简单且不存在Fc 段的糖基化问题，故可通过低真核和原核表达系统，表达1-2多肽链来生产，从而具有高产和降低成本的优势。 ?Non lgG-like BsAb 的亲和捕获 针对 Non lgG-like BsAb，Cytiva 提供高特异性亲和层析技术为核心的纯化技术平台(图3-2)。亲和捕获一步即可达到较高的纯度和回收率。 Mabselect PrismA 耐碱改构的蛋白A配基,不仅可以结合Fc片段,还跟 MabSelect、MabSelect Xtra 一样,可以结合重链可变区 VH，因此能够特异性结合抗体片段 VHH,即可以对纳米抗体进行高效捕获; 来源于链球菌的 ProteinG能高特异性的与lgG 的Fc片段和 CH1 结构域结合,也适用于纯化 Fab 片段；Capto L将L蛋白偶联于高流速琼脂糖骨架，L蛋白能够高特异性的结合 kappa轻链的可变区，可用于对相应ScFv、Fab、Dab 等的亲和捕获;KappaSelect能高特异性结合kappa轻链恒定区，而LambdaFabSelect 能特异性结合 Lambda轻链恒定区，一步可以达到高纯度和高回收率。 Non lgG-like BsAb 的精纯 Capto Adhere 精纯Tandem ScFv BsAb 对于抗体药而言,仅一步亲和是远不够的,多模式复合填料 Capto Adhere 能一步去除内毒素,DNA,聚集体,HCP等。图3-4中，在继ProteinL(Capto L/KappaSelect)对Tandem ScFv BsAb 特异性捕获之后，采用 Capto Adhere的结合洗脱模式，优化洗脱条件，改变洗脱盐浓度，平衡纯度与回收率。最终在保障回收率的前提下，去除了大量的残留聚集体，将TandemScFvBsAb的单体纯度从92.3% 提高到 98.8%,满足工业生产需求 图· Capto Adhere 精纯 Tandem ScFv BsAb 去除聚集体 案例分享 Non lgG-like BsAb 纯化案例很多，不乏MabSelect PrismA，Capto L，KappaSelect， LambdaFabSelect等进行捕获的工业级别案例，同时精纯步骤，高分辨率的阳离子与多模式复合填料也都得到了广泛应用。如下图，Capto L高效捕获含有 kappa 轻链的可变区的Fab 片段，一步亲和收率高达97.3%，经阳离子层析Capto SP lmpRes 和阴离子层析Capto Q之后，Fab 纯度高达 99.2%，同时 total 收率高达 86.8%。 图· CaptoL-CaptoSPlmpRes-Capto Q 纯化 Fab fragment 同样，Capto L能够高效捕获仅含有 kappa 轻链的可变区的 Dab 片段(如下图)，一步亲和收率高达 99.6%，经高分辨率多模式层析填料 Capto MMC ImpRes (B-E)和高分辨率多模式层析填料 Capto Adhere lmpRes (FT)之后有效去除大肠表达Dab 过程中伴随的ECP和内毒素等杂质，获得高纯 Dab，同时三步层析总收率高达80.8%。 图· Capto L-Capto MMC ImpRes-Capto Adhere lmpRes 纯化 Dab fragment 对于自行构建的特殊Non lgG-like BsAb(Fab-CH2-ScFv)，KappaSelect高特异性结合其 kappa轻链恒定区，高效捕获该 BsAb分子，后续通过 Capto Q和 Phenyl sepharose HP 的流穿模式，简单高效的去除了大量的 LCD，LC以及aggregate杂质。最终Fab-CH2-ScFv 的 SEC 纯度高达 97.7%,满足工业生产需求。 KappaSelect-Capto Q-Phenyl Sepharose HP 纯化 BsAb (Fab-CH2-ScFv) 关于太阳成集团tyc122cc入口百澳生物 生命科学领域快速消费品及配套服务的专业供应商，总部位于泰州医药城，上海、广州、南京、成都、苏州、杭州、武汉等地设有分公司及办事处。 产品线涵盖精准医疗、抗体、疫苗、CGT、分子生物学与细胞生物学、常规临床检验、药物筛选、基因组学与蛋白质组学等研究和应用领域，以“技术+产品+服务”的一体化模式服务客户。 部分图片、字体、文字来源于网络 如有侵权请联系删除
